2、用10.0 mL吸管吸取5.0 mL～10.0 mL第3代～5代的18 h～24 h營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，接種于羅氏瓶（或細(xì)胞培養(yǎng)瓶）營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，將其搖動(dòng)使菌液布滿培養(yǎng)基表面，將多余肉湯培養(yǎng)物吸出，羅氏瓶（或細(xì)胞培養(yǎng)瓶）置36 ±1 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d～7 d。

 

3、用接種環(huán)取少許菌苔涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法：用接種環(huán)取菌苔涂于玻片上，自然干燥后，通過火焰加熱將菌固定于玻片上；將涂片放入平皿內(nèi)，片上放兩層濾紙，滴加足量的5.0%孔雀綠水溶液，將平皿蓋好，置55 ±1 加熱30 min。取出，去濾紙，用自來水沖去殘留液；加0.5%沙黃水溶液，1 min后水洗，待干后鏡檢。芽胞呈綠色，菌體呈紅色。在顯微鏡（油鏡）下鏡檢，當(dāng)芽胞形成率達(dá)90%以上時(shí)，即可進(jìn)行以下處理。否則，繼續(xù)在室溫下放置一定時(shí)間，直至達(dá)到上述芽胞形成率后再進(jìn)行以下處理。

 

4、加10.0 mL無菌蒸餾水于羅氏瓶（或細(xì)胞培養(yǎng)瓶）中，以L棒輕輕刮下菌苔，吸出，再加入5.0 mL無菌蒸餾水沖洗培養(yǎng)基表面，吸出。將兩次吸出的菌懸液集中于含玻璃珠的無菌錐形燒瓶中，振搖5 min。

 

5、將燒瓶置45 水浴24 h，使菌自溶斷鏈，分散成單個(gè)芽胞。

 

6、用無菌棉花或紗布過濾芽胞懸液，清除瓊脂凝塊。

 

7、將芽胞懸液置無菌離心管內(nèi)，以3000 r/min速度離心30 min。棄上清液，加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗，本步驟重復(fù)進(jìn)行3遍。

 

8、將洗凈的芽胞懸液放入含適量小玻璃珠的燒瓶內(nèi)，80 水浴10 min（或60 水浴30 min），以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體。待冷至室溫后，搖勻分裝后冷藏保存?zhèn)溆茫行褂闷?個(gè)月。

 

9、芽胞懸液在使用時(shí)，先進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

 

10、懷疑有污染時(shí)，以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定。

 

本文節(jié)選自中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《WS/T 683—2020消毒試驗(yàn)用微生物要求》。