細胞復蘇、傳代與凍存操作流程

一、 儀器與試劑

二、操作流程：

復蘇

1) 將恒溫水浴鍋中的水預熱到37℃；

2) 從液氮罐中取出要復蘇的細胞，盡快轉入恒溫水浴鍋中復溫，不斷震蕩凍存管以提高復溫速率；

3) 將融化了的凍存管中的用移液管轉入一直裝有5ml完全培養基的15ml離心管中，充分混勻后，300g離心5min；

4) 離心完成后棄去上清，用1ml完全培養基重懸細胞后，轉入T-25細胞培養中，再加完全培養基4ml，之后轉入CO₂培養箱中培養靜置。

傳代

1) 將需要那傳代的細胞從CO₂培養箱中取出，在生物安全柜內，打開培養瓶瓶口，吸棄瓶內的培養基；

2) 向培養內加入無菌1×PBS 3ml，之后水平放置培養瓶，旋轉震蕩培養瓶，使PBS能夠浸潤到培養平面上所都的面積，吸棄PBS；

3) 重復步驟2一次，之后向瓶內加入消化液2ml，輕微震蕩后放入37℃ CO₂培養箱中孵育1min；

4) 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細胞是否變圓飄起，如還有部分細胞未消化下來，可在生物安全柜內用移液管吸起消化液，吹打培養平面；

5) 向消化下細胞的培養瓶中加入3ml完全培養基終止消化，然后將培養瓶中的液體轉入15ml離心管中，300g離心5min；

6) 離心完成后，棄上清，用2ml完全培養基重懸細胞，將重懸后的培養基轉入2個T-25培養瓶，每個培養瓶各1ml，提前向每個培養瓶中各加入4ml完全培養基；

7) 水平放置培養瓶，旋轉震蕩培養瓶，使細胞均勻分部在培養平面上，然后將培養瓶置于CO₂培養箱中靜置培養。

注意：

a) 每次消化不超過2min，如果消化2min后，培養瓶中還有較多細胞貼壁，可采用分步消化，將消化下來的細胞移入15mL離心管中和，再向培養瓶中加入胰酶繼續消化，每次消化不超過2min，直到完全消化下來為止。

b) 細胞傳代建議1傳2。

凍存

1) 將需要那凍存的細胞從CO₂培養箱中取出，在生物安全柜內，打開培養瓶瓶口，吸棄瓶內的培養基；

2) 向培養內加入無菌1×PBS 3ml，之后水平放置培養瓶，旋轉震蕩培養瓶，使PBS能夠浸潤到培養平面上所都的面積，吸棄PBS；

3) 重復步驟2一次，之后向瓶內加入消化液2ml，輕微震蕩后放入37℃ CO₂培養箱中孵育1min左右；

4) 孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細胞是否變圓飄起，如還有部分細胞未消化下來，可在生物安全柜內用移液管吸起消化液，吹打培養平面；

5) 向消化下細胞的培養瓶中加入3ml含10%血清的完全培養基終止消化，然后將培養瓶中的液體轉入15ml離心管中，300g離心5min；

6) 離心完成后，棄上清，用1mL凍存液重懸細胞沉淀，然后轉入1.8ml凍存管中；

7) 將凍存管轉入填充滿異丙醇的程序降溫盒中，之后轉入-80℃冰箱中過夜降溫；

8) 第二天，取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管，盡快轉入液氮罐中保存。

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